Basic data
| Activiteitencentrum | Sint-Jan |
| Database | Moleculaire microbiologie |
| Groep | Virale DNA/RNA detectie |
| Code | 55039 |
| Verzending | Nee |
Detail data
| Lichaamsmateriaal voorkeur | RNA extracten van respiratoire stalen die eerder via PCR positief werden getest op het Sars-CoV-2 virus |
| Recipient voorkeur | NVT |
| Mininum vereiste volume | Cf. PCR SARS-CoV-2 |
| Analysevolume | 5 μl RNA extract van stalen die eerder positief werden getest op Sars-CoV-2 via PCR. Om maximale kans op resultaat te hebben, dient de Ct-waarde van de diagnostische PCR niet hoger te zijn dan 27 (PCR op Cobas6800 of GeneXpert) |
| Bewaarcondities en voorbehandeling | Stalen die in aanmerking komen zitten ingevroren bewaard |
| Acceptatiecriteria staalontvangst | Correct en onbeschadigd recipiënt met duidelijke identificatiegegevens. |
| Acceptatiecriteria bijaanvraag | Indien het initiële respiratoire monster een correcte pre-analytische fase doorliep en veilig bewaard zit (en een Ct-waarde had van max. 27), is dit toegelaten. |
| Analyse frequentie | geen routinetest meer |
| 24/24uur | Neen |
| Verantwoordelijk klinisch bioloog | Dr. Marijke Reynders |
| Uitvoerende laboratoriumdienst/afdeling | Dienst Laboratoriumgeneeskunde; Operationele Eenheid Moleculaire Biologie; Werkpost Moleculaire Biologie - Microbiologie |
| Techniek/methode | Na omzetting van het RNA naar cDNA, wordt met het QIASeq Sars-CoV-2 primer panel in 2 multiplex PCR reacties het volledige virale genoom geamplificeerd. De gebruikte primers zijn gebaseerd op de primers die werden ontwikkeld binnen het Artic netwerk voor moleculaire epidemiologie van uitbraakinfecties (https://artic.network/ncov-2019). Na target amplificatie wordt het product gezuiverd, en wordt de concentratie gemeten (Figuur 1A). Met een genormaliseerde hoeveelheid amplicon wordt vervolgens een sequencing library aangemaakt met de QIAseq FX Library Kit (Figuur 1B). Deze stap bestaat uit fragmentatie, adapter ligatie, cleanup en library amplificatie. Na cleanup van de libraries worden deze equimolair gepoold en gesequenced via het ‘sequencing by synthesis’ principe op een Illumina MiSeq toestel. Voor het principe van SBS op de Illumina platformen, zie educatieve bronnen op het internet of de respectievelijke toestel-SOP’s (MBNATAU00015, MiSeq en MBNATAU00018, NextSeq). |
| Mogelijke interferenties | NVT |
| Toestel | Sequencing op Illumina MiSeq |
| Eenheid of kwalitatief | Kwalitatief |
| Referentie waarden | Uit de validatie blijkt dat bij 97,6% van de stalen met Ct tussen 11,7 en 29,4 de NGS run succesvol is met een opbrengst van minstens 1 miljoen reads. In principe worden geen stalen met Ct >27 gebruikt omdat de uitval bij dergelijke stalen een stuk hoger kan zijn. |
| Interpretatie | Na de NGS run worden de ruwe data (fastq) verwerkt in CLC genomics workbench en wordt een consensus sequentie (fasta) gegenereerd. Uit deze fasta wordt het genotype bepaald via de online Pangolin Covid-19 Lineage Assigner (https://cov-lineages.org). Hieruit kan ook het WHO label voor ‘variants of concern’ (Alfa, Delta, Omikron,…) worden afgeleid. Ter confirmatie van het genotype worden de sequenties ook nog eens geanalyseerd in Nextclade (https://clades.nextstrain.org). Deze tool maakt ook een interpretatie van de aminozuurwijzigingen op basis van de consensus sequentie. Het eindresultaat dat wordt ingegeven in GLIMS bestaat uit • De Sars-CoV-2 clade volgens Nextclade classificatie (vb. 21K, 21J,…) in te vullen in het resultaatveld COV.CLA_NGS • De Sars-CoV-2 lineage volgens de Pangolin classificatie (vb. BA.1,BA.2,…), in te vullen in het resultaatveld COV.PAN.CLA_NGS • Spike aminozuursubstituties, deleties en inserties volgens NextClade (informatief), in te vullen in COV.S.MUT_NGS • Het besluit (COV.BES_NGS) met het WHO label voor ‘variant of concern’ (Delta, Omikron,…). Indien relevant, kan in overleg met de moleculair bioloog in het besluit nog handmatig commentaar worden toegevoegd (bvb. niet geclassificeerde variant, bijkomende zorgwekkende mutaties, recombinant virus,…). Resultaten worden na ingave in GLIMS steeds nagekeken en geconfirmeerd door de moleculair bioloog na dubbelcheck van de resultaten in Pangolin en Nextclade. Finaal volgt authorisatie door de klinisch bioloog microbiologie. Op vraag van het Nationaal referentiecentrum worden resultaten van Sars-CoV-2 genotypering in kader van baseline surveillance opgeladen in de internationale databank GISAID. |
| Deelname EKE | Ringtest binnen "Nationale NGS-netwerk" |
| Accreditatie | NVT |
| Aanvraagformulier | NVT |
| RIZIV nr | NVT |
| B-waarde | NVT |
| Versiedatum | 5/06/2023 |
